PCR sakkiz trubkali to'plamni ishlatishdan keyin yuvishimiz kerak. PCR Octal to'plamini tozalashning bir necha yo'li mavjud. Foydalanishda nimalarga e'tibor berishim kerak?
Eksperimental usul printsipi: Silikagel membranasi yuqori tuz sharoitida DNK bilan bog'lanadi va past tuz sharoitida DNKdan ajralib chiqadi. Primerlar, mononukleotidlar, fermentlar, mineral moylar, tuz ionlari va boshqalar DNKga o'xshash xususiyatlarga ega emasligi sababli DNK o'z ichiga olgan yuvish eritmasida ajratiladi.
Eksperimental materiallar: PCR mahsulotlari, reagentlar, to'plamlar, PCR tozalash to'plamlari, asboblar, sarf materiallari, 96-quduq DNK tayyorlash plitalari, 96-quduq chuqurlikdagi plitalar, 96-V shaklidagi yaxshi plitalar
1. PCR sakkiz trubkasi ishlab chiqaruvchisi to'plamning tarkibi, saqlanishi va barqarorligi haqida gapiradi
1. Ko'rsatmalar, sarf materiallari: 96-quduq DNK tayyorlash plitasi, 96-quduq 1,6ml chuqurlikdagi plastinka, 96-quduq V shaklidagi plastinka.
2. Bufer PCR-A: DNKni bog'lovchi eritma. Xona haroratida mahkam yopiq holda saqlang. Agar yog'ingarchilik paydo bo'lsa, uni ishlatishdan oldin 65 daraja issiq hammomda eritib, xona haroratiga qadar sovutish kerak.
3. Bufer W2 konsentrati: tuz eritmasini olib tashlang. Ishlatishdan oldin shishada ko'rsatilgan hajmga etanol qo'shing, yaxshilab aralashtiring va xona haroratida saqlang. 100 foiz etanol yoki 95 foiz mutlaq etanol ishlatilishi mumkin.
4. Eluent: 2,5 mM Tris-HCl, pH 8,5, yopiq holatda xona haroratida saqlanadi.
2. Sakkiz juftlikli PCR naychalari ishlab chiqaruvchisi operatsiya bosqichlari haqida gapiradi
Foydalanuvchilar salbiy bosim yoki santrifüjni tanlashi mumkin.
A. Salbiy bosim usuli
1. Manfiy bosim moslamasini to'g'ri ulang, manfiy bosim qurilmasiga 96-quduq DNK tayyorlash plitasini joylashtiring; PCRga 3 marta bufer PCR-A qo'shing, ferment hazm qilish, fermentni belgilash yoki sekvensiya reaktsiyasi eritmasi (agar PCR-A buferi 100 ul dan kam bo'lsa, 100 ul qo'shing); yaxshilab aralashtiramiz va 96-quduqli DNK tayyorlash plastinkasiga o‘tkazing, yoqing va salbiy bosimni -25-30 dyuym Hg ga sozlang va plastinkadagi eritmani asta-sekin aspiratsiya qiling.
2. 0.3 ml bufer W2 qo'shing va eritmani so'rib oling. Xuddi shu tarzda 0.3 ml W2 buferi bilan ikki marta yuving.
Reagent shishasida ko'rsatilgan Bufer W2 konsentrati hajmiga mutlaq etanol qo'shilganligini tasdiqlang.
3. Salbiy bosimni ushlab turing va 96-quduq DNK tayyorlash plitasini 10 daqiqa davomida chiqarib oling.
4. Uzun tolali to'qimalarda 96-quduqli DNK tayyorlash plitasini drenaj trubkasi pastga qaratib 6 marta maydalang.
5. 96-Quduq DNK tayyorlash plitasini 96-quduqli V shaklidagi plastinka ustiga qo'ying, membrananing o'rtasiga 25-30ul suv yoki elute qo'shing va 1 daqiqaga qoldiring. xona haroratida. DNK 5 minut davomida 3 000 xg da sentrifugalash yoʻli bilan elut qilindi.
B. Santrifüj
1. PCR, hazm qilish, ferment belgilari yoki ketma-ketlik reaktsiyalariga 3 hajmli Bufer PCR-A qo'shing (agar Bufer PCR-A 100 ul dan kam bo'lsa, 100 ul qo'shing); aralashtiriladi va 96-quduq DNKsi 96-quduq tayyorlash plastinkasiga o‘tkaziladi. DNK tayyorlash plitasini 96-quduqli 1,6 ml chuqurlikdagi plastinaga joylashtiring, 1000 xg da 1 minut sentrifuga qiling va filtratni tashlang.
2. 96-Quduqli DNK tayyorlash plastinkasiga 0,3 ml bufer W2 qo‘shing, 1000×g da 1 daqiqa davomida sentrifuga qiling va filtratni tashlang. 0,3 ml bufer W2 bilan yana xuddi shu tarzda yuving. Reagent shishasida ko'rsatilgan Bufer W2 konsentrati hajmiga mutlaq etanol qo'shilganligini tasdiqlang.
3. 96-Quduq DNK tayyorlash plitasini 96-quduqli 1,6 ml chuqurlikdagi plastinkaga joylashtiring va 3 000×g darajasida 10 daqiqa sentrifuga qiling.
4. 96-Quduq DNK tayyorlash plastinasini toza 96-quduqli V shaklidagi pastki plastinkaga joylashtiring, membrananing o‘rtasiga 25-30ul suv yoki elute qo‘shing va to‘xtab turing. Xona haroratida 1 daqiqa. DNK 5 minut davomida 3 000 xg da sentrifugalash yoʻli bilan elut qilindi.
PCR oktal naychalari ishlab chiqaruvchilari e'tiborga muhtoj bo'lgan masalalar haqida gapirishadi:
1. Eluent yoki suvni 65 gradusgacha qizdirish elutsiya samaradorligini oshirishga yordam beradi.
2. DNK molekulalari kislotali, 2,5 mM Tris-HCl, pH 8,5 eluatda saqlash tavsiya etiladi.
