Siz endigina o'qishni tugatib, ishga kirganingizda, siz real vaqt rejimida PCR miqdori bo'yicha tajribalar o'tkazadigan bir qator otlarga duch kelasiz. Qayerdan boshlashni bila olmayapsizmi? Kuchaytirish egri chizig'i, standart egri chiziq, chegara, KT qiymati, erish egri chizig'i va asosiy chiziq nimani anglatadi? Ushbu tajribalardagi lyuminestsent tasvirlar juda yorqin, ammo men ularni aniqlay olmayapman. Bugun biz sizni ushbu bilim va tushunchalarni ikki qismdan o'rganishga olib boramiz: texnik atamalar va tez-tez beriladigan savollar.
I qism Professional shartlar
1. Kuchaytirish egri chizig'i
Kuchaytirish egri chizig'i egri chiziqqa ishora qiladi, bunda sikl raqami abscissa va real vaqtdagi lyuminestsent intensivligi PCR paytida ordinat hisoblanadi.
2. Asosiy
Asosiy nuqta PCR kuchaytirish reaktsiyasining dastlabki bir necha tsikllari davomida floresan signalning ozgina o'zgarishini anglatadi. Signal darajasi to'g'ri chiziqqa yaqinligini ko'rsatadi, bu asosiy chiziqdir.
3. Floresansiya chegarasini sozlash
Odatda, PCR reaktsiyasining dastlabki 15 siklidagi floresans signali floresan fon signali sifatida ishlatiladi va floresans chegarasi PCRning 3-15 sikllari davomida floresans signalining standart og'ishidan 10 baravar va floresans chegarasi. PCR kuchaytirilishining eksponensial bosqichida o'rnatiladi. Odatda, har bir asbob ishlatishdan oldin o'zining floresans chegarasiga ega.
4. KT qiymati
KT qiymati lyuminestsent signal belgilangan chegaraga yetganda har bir PCR reaksiya trubkasi uchun sodir bo'ladigan tsikllar sonini ifodalaydi. Tadqiqotdan ma'lumki, har bir shablonning KT qiymati va ushbu shablonning boshlang'ich nusxasi sonining logarifmi o'rtasida chiziqli bog'liqlik bor. Dastlabki nusxa raqami qanchalik baland bo'lsa, CT qiymati shunchalik kichik bo'ladi va aksincha. Ma'lum bo'lgan boshlang'ich nusxa raqamlari bo'lgan standartlardan foydalanib, kalibrlash egri chizig'ini yaratish mumkin, bu erda abscissa boshlang'ich nusxa raqamining logarifmini, ordinata esa CT qiymatini ifodalaydi. Shuning uchun, noma'lum namunaning CT qiymati olingan ekan, namunaning dastlabki nusxasi raqami standart egri chiziqdan hisoblanishi mumkin.
ko'proq bilish
Kuchaytirish egri chizig'i yaxshi yoki yo'qligini aniqlash uchun bir nechta ko'rsatkichlar mavjud:
Javob: Egri chiziqning burilish nuqtasi aniq, ayniqsa past og'ir fraktsiyali namunaning eksponensial bosqichi aniq, kuchaytirish egri chizig'ining umumiy parallelligi juda yaxshi, asosiy chiziq tekis, ko'tarilish hodisasi yo'q va kuchaytirish. past darajadagi eksponensial faza konsentratsiyasi namunasining egri chizig'i juda yaxshi. aniq.
B: Egri chiziqning eksponentsial fazasining qiyaligi kuchaytirish samaradorligiga to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir, nishab qanchalik katta bo'lsa, kuchaytirish samaradorligi shunchalik yuqori bo'ladi.
C: Standart bazaviy chiziq tekis yoki biroz pasayib bormoqda, aniq ko'tarilish tendentsiyasi yo'q.
D: Har bir naycha uchun kuchaytirish egri chizig'ining parallelligi yaxshi, bu har bir reaksiya trubasining kuchaytirish samaradorligi o'xshashligini ko'rsatadi.
5. Erish egri chizig'i
PCR mahsuloti qizdirilganda, harorat ko'tarilganda, ikki qatorli kuchaytiruvchi mahsulot asta-sekin ajralib chiqadi, bu esa floresan intensivligining pasayishiga olib keladi. Muayyan haroratga erishilganda, ko'p miqdorda mahsulot ajralib chiqadi, natijada floresans keskin kamayadi. Ushbu funktsiyani turli xil PCR mahsulotlari uchun turli xil TM qiymatlari bilan birgalikda ishlatish, shuningdek, lyuminestsent signal tez pasayadigan haroratda farq qiladi, bu PCR o'ziga xosligini aniqlashning yaxshi usuli bo'lishi mumkin.
6. Erish egri chizig'i (logarifmik egri chiziq yordamida)
Tepalik grafigi mahsulot bo'laklarining holatini yanada intuitiv ravishda ko'rsatish uchun erish egri chizig'ining logarifmi bilan shakllanadi. Erish harorati DNK bo'lagining TM qiymati bo'lganligi sababli, DNK fragmentining TM qiymatiga ta'sir qiluvchi ba'zi parametrlarni aniqlash mumkin, masalan, fragment o'lchami, GC tarkibi va boshqalar. Umuman olganda, bizning primer dizayn printsipimizga ko'ra, odatda aytiladi. kuchaytirilgan mahsulotning uzunligi 80-300bp oralig'ida va erish harorati 80 daraja va 90 daraja orasida bo'lishi kerak.
Javob: Agar 80 daraja va 90 daraja orasida faqat bitta asosiy cho'qqi bo'lsa, bu real vaqtda PCR mukammal ekanligini anglatadi.
B: Agar asosiy tepalik 80 dan 90 gradusgacha ko'rinsa va nopoklik cho'qqisi 80 darajadan past bo'lsa, primer-dimer asosan hisobga olinadi. Bu tavlanish haroratini oshirish orqali hal qilishga harakat qilish uchun yaxshi variant.
C: Agar asosiy cho'qqi 80 dan 90 darajagacha ko'rinsa va harorat ko'tarilganda aylanib yuruvchi cho'qqi paydo bo'lsa, asosan DNKning ifloslanishi hisobga olinadi. Va DNKni tajribaning dastlabki bosqichlarida olib tashlash kerak.
7. Standart egri chiziq
Standart standartlar turli konsentratsiyalarda suyultirildi va PCR reaktsiyalari uchun shablon sifatida foydalanildi. Standart egri chiziq abscissa sifatida standart nusxa raqamining logarifmi va ordinata sifatida o'lchangan KT qiymati bilan chiziladi. Noma'lum namunaning miqdorini aniqlashda namunaning nusxasi raqami noma'lum namunaning CT qiymatiga asoslangan standart egri chiziqdan olinishi mumkin. Standart egri chiziqlar mutlaq miqdorni aniqlash uchun juda muhimdir.
ikkinchi qism. umumiy muammo
1-savol: RT-PCR, QPCR, real vaqtda PCR va real vaqtda RT-PCR o'rtasidagi farq nima?
A1: RT-PCR teskari transkripsiyali PCR bo'lib, polimeraza zanjiri reaktsiyasining keng qo'llaniladigan variantidir. RT-PCR da RNK zanjiri teskari ravishda komplementar DNKga transkripsiyalanadi, so'ngra u PCR orqali DNKni kuchaytirish uchun PCR uchun shablon sifatida ishlatiladi.
Haqiqiy vaqtda PCR va QPCR bir xil narsa, ikkalasi ham real vaqtda miqdoriy PCR, ya'ni PCR jarayonida har bir tsiklda ma'lumotlarning real vaqt rejimida qayd etilishi mavjud. Shu tarzda, ishga tushirish shablonlari sonini aniq tahlil qilish mumkin.
Garchi real vaqtda PCR ham, teskari transkripsiyali PCR ham RT-PCR sifatida qisqartirilgan bo'lsa-da, xalqaro konventsiyaga ko'ra, RT-PCR maxsus teskari transkripsiyali PCRga ishora qiladi, real vaqtda PCR esa ko'pincha qPCR (Quantitative Real-) deb qisqartiriladi. Haqiqiy Haqiqiy-Haqiqiy Haqiqiy PCR ) - vaqtli PCR).
Haqiqiy vaqtda RT-PCR (RT-QPCR) floresan miqdoriy metodlarni birlashtirgan teskari transkripsiyali PCR turidir: cDNK (RT) olish uchun RNKdan birinchi teskari transkripsiya, so'ngra real vaqtda PCR (QPCR) yordamida miqdoriy tahlil.
2-savol: Nima uchun lyuminestsent miqdoriy PCRning kuchaytirilgan mahsulot qismi uzunligi 80-300bp oralig'ida nazorat qilinadi?
A2: Har bir gen ketma-ketligining uzunligi har xil, ularning ba'zilari bir necha Kb va yuzlab BP. Biroq, primerni loyihalashda biz faqat mahsulot uzunligini 80-300bp bo'lishini talab qilishimiz kerak, va juda qisqa yoki juda uzun bo'lganlar miqdoriy PCRni aniqlash uchun mos emas.
Mahsulot bo'laklari primer-dimerlardan ajralib turish uchun juda qisqa. Primer-dimerning uzunligi taxminan 30-40bp ni tashkil qiladi, u 80bp dan kam bo'lsa, u primer-dimer yoki mahsulot ekanligini farqlash qiyin. Agar mahsulot fragmenti juda uzun bo'lsa, 300bp dan oshsa, bu osonlikcha past kuchaytirish samaradorligiga olib keladi va gen miqdori samarali tarzda aniqlanmaydi.
Misol uchun, sinfdagi odamlar sonini hisoblaganingizda, faqat qancha og'iz borligini hisoblashingiz kerak. Genlarni sinashda ham xuddi shunday. Butun ketma-ketlikni ifodalash uchun siz faqat genning ma'lum bir ketma-ketligini aniqlashingiz kerak. Agar siz odamlarni sanash uchun og'iz va burun, quloq va ko'zoynakni hisoblasangiz, xato qilish oson.
3-savol: Astar dizayni uchun optimal uzunlik qanday?
A3: Umuman olganda, 20-24bp oralig'idagi primer uzunligi yaxshi. Albatta, biz primerni loyihalashda primerning TM qiymatiga e'tibor berishimiz kerak, chunki u optimal tavlanish harorati bilan bog'liq. Ko'pgina tajribalardan so'ng, 60 daraja yaxshi TM qiymati ekanligi isbotlangan. Past tavlanish harorati osongina o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishga olib kelishi mumkin, yuqori tavlanish harorati esa odatda past kuchaytirish samaradorligiga, kuchaytirish egri chizig'ining kech cho'qqisiga va kechiktirilgan CT qiymatiga olib keladi.
4-savol: Yig'ilgan namunalar miqdori eksperimental natijalarga ta'sir qiladimi?
A4: Yo'q. Shubhasiz, qancha ko'p namunalar to'plangan bo'lsa, shuncha ko'p RNK olinadi, shuncha ko'p cDNK va ko'proq maqsadli fragmentlar bo'ladi. Mutlaq miqdorni aniqlash uchun maqsadli fragmentning nusxa raqamini hisoblash kerak va to'plangan namuna miqdori, albatta, eksperimental natijalarga ta'sir qiladi. Masalan, qonda gepatit C virusi HBV ni aniqlash, ma'lum miqdorda (1 ml) qonda HBV tarkibini aniqlashdir.
Ilmiy tadqiqotlarda keng qo'llaniladigan nisbiy miqdorni aniqlash uchun namunalar soni eksperimental natijalarga hech qanday aloqasi yo'q, chunki nisbiy miqdorni aniqlash maqsadli gen va etalon gen o'rtasidagi taqqoslashni anglatadi. Iltimos, ularni bir xil nuklein kislota zanjirida mavjud bo'lgan yuqori va quyi oqim qismlari sifatida ko'rib chiqing. Namuna hajmi katta bo'lsa, mos yozuvlar va maqsadli genlar bir vaqtning o'zida teng nisbatda oshiriladi, bu natijalarga ta'sir qilmaydi.
5-savol: Teskari transkriptaza samaradorligi eksperimental natijalarga ta'sir qiladimi?
A5: Yuqoridagi kabi. E'tibor bering, biz yuqori RT samaradorligini xohlaymiz, lekin biz RT fermenti nisbatan barqaror bo'lishini va bir xil natijalarni olishni afzal ko'ramiz. Bu yirik kompaniyalarning teskari transkripsiya to'plamlarining optimallashtirilgan imkoniyatlarining sinovi bo'ladi.
6-savol: TAQ fermentining samaradorligi eksperimental natijalarga ta'sir qiladimi?
A6: TAQ fermentining samaradorligi nisbatan katta. Odatda, issiq start taq fermentlari talab qilinadi va nisbatan samaralidir. Savdo floresan miqdoriy to'plamlari uchun har bir ishlab chiqaruvchi o'z mahsulotlariga ko'ra eng yaxshi holatning samaradorligini optimallashtiradi 100 foizga yaqin , samaradorlik juda past bo'lsa, eksperimental natijalarni olish mumkin emas. Turli kompaniyalarning mahsulotlari uchun bu sifat o'lchovidir.
7-savol: Floresan bo'yoq miqdori eksperimental natijalarga ta'sir qiladimi?
A7: Ha, shunday bo'ladi. Agar ftoroxrom juda to'yingan bo'lsa, u ba'zi asboblarda shovqin shovqiniga olib kelishi mumkin. Agar floroxrom to'yinmagan bo'lsa va flüoresans qiymati juda past bo'lsa, u erta plato bosqichiga kiradi va kuchaytirish egri chizig'i tekis bo'ladi. Floresan miqdoriy tajribasida CT qiymati asosan ko'rinadi, shuning uchun kech kuchaytirish egri plato bosqichiga kirishi muhim emas, lekin rasm etarlicha chiroyli emas. Agar siz tanlagan bo'lsangiz, biroz kamroq to'yingan ftoroxromni tanlab boshlang. Biroq, xuddi shu kompaniyaning bir xil mahsulotidan foydalanganda, uning ta'siri asosan ahamiyatsiz.
8-savol: PCR naychasining uzatilishi eksperimental natijalarga ta'sir qiladimi?
A8: Ha. Biroq, xuddi shu ishlab chiqaruvchining bir xil partiyasi uchun bu ta'sirni e'tiborsiz qoldirish mumkin. Bu yaxshi tanlovdir va sarf materiallarining yorug'lik o'tkazuvchanligi ta'sirini minimallashtirish uchun 96-o'tkazuvchanligi yuqori membranali quduq plastinkasidan foydalanish yaxshidir.
9-savol: Ishlash paytidagi xatolar eksperimental natijalarga ta'sir qiladimi?
A9: Operatsion jarayonining ta'siri asosan bir xillikda namoyon bo'ladi. Bir hillik tizimdagi barcha komponentlar teng ravishda aralashtirilganligini anglatadi va flesh-tsentrifugalash bu muammoni hal qilishi mumkin. Bundan tashqari, yangi boshlanuvchilar uchun PCR tizimini 20 dyuymdan oshiqroq qilib sozlash eng yaxshisidir va juda kichik tizim xatolarga ko'proq moyil bo'ladi. Agar yumshatish harorati to'g'ri optimallashtirilgan bo'lsa, primer konsentratsiyasining KTga ta'siri minimallashtiriladi. Va siz ba'zi operatsion xatolarni (masalan, primer konsentratsiyasi) yumshatish haroratini optimallashtirish orqali oldini olish mumkinligini bilib olasiz.
Xulosa qiling
Yuqoridagilar tajriba davomida yangi boshlanuvchilar tez-tez duch keladigan ba'zi savollar va savollar, umid qilamizki, bu savollar sizni chalkashliklarni hal qilishga yordam beradi. Tajriba - bu tartibsizlikni keltirib chiqarish va muammolarni hal qilish jarayoni, umid qilamanki, siz undan biror narsa olasiz. O'qiganingiz uchun tashakkur va keyingi safar ko'rishamiz!
