PCR texnologiyasida sun'iy ravishda sintezlangan oqilona primerlar va olingan DNK namunasi bo'lishi kerak, so'ngra avtomatik termal tsiklni amalga oshirishi va nihoyat mahsulotni identifikatsiyalash va tahlil qilishni amalga oshirishi kerak. Hozirgi vaqtda primerni loyihalash va sintez qilish faqat kuchli texnik kuchga ega bo'lgan bir nechta ilmiy-tadqiqot institutlari, institutlari va klinikalarida amalga oshirilishi mumkin. Ishni boshlash uchun dastur faqat PCR aniqlash to'plamini sotib olishi kerak. PCR avtomatik termal siklida ko'plab ta'sir qiluvchi omillar mavjud. Turli DNK namunalari uchun PCR reaktsiyasiga qo'shilgan turli komponentlar miqdori va harorat aylanishi parametrlari bir-biriga mos kelmaydi.
Endi bir nechta asosiy ta'sir etuvchi omillar quyida keltirilgan.
Birinchisi, harorat aylanishi parametrlari
PCR avtomatik termal siklida eng muhim omil denaturatsiya va tavlanish haroratidir. Amaliyot misolida ko'rsatilganidek, denatürasyon, yumshatish va uzaytirish shartlari: 94 ℃ 60s, 37 ℃ 60 s, 72 ℃ 120 s, jami 25 ~ 30 A sikl, kuchaytirilgan fragment 500bp. Bu erda har bir bosqichning vaqtini reaksiya aralashmasi kerakli haroratga etganidan keyin hisoblash kerak. Avtomatik termal tsiklda aralashmaning dastlabki haroratidan kerakli haroratgacha bo'lgan vaqt 30-60 soniyani tashkil qiladi. manba (suv hammomi yoki isitish bloki) va issiqlik davrini o'rnatishda etarli darajada ta'minlanishi kerak bo'lgan ikki bosqich o'rtasidagi harorat farqiga e'tibor bering va hisobga oling va har bir asbobda haqiqiy o'lchov amalga oshirilishi kerak.
Termal aylanish vaqti haqida yana bir muhim e'tibor - bu ikki primer orasidagi masofa; masofa qanchalik uzoq bo'lsa, maqsadli ketma-ketlikning to'liq uzunligini sintez qilish uchun qancha vaqt kerak bo'ladi. Yuqorida keltirilgan reaksiya vaqti optimal sintez uzunligi 500bp ga asoslangan. Maqsadli ketma-ketlik tuziladi. Bu erda turli xil haroratlarni tanlashga kirish.
1. Shablon denaturatsiya harorati Denaturatsiya harorati PCR reaksiyasida ikki zanjirli DNK eriydigan haroratni aniqlaydi. Agar denaturatsiya haroratiga erishilmasa, bitta zanjirli DNK shablonlari ishlab chiqarilmaydi va PCR boshlanmaydi. Past denaturatsiya harorati to'liq bo'lmagan denatürasyon degan ma'noni anglatadi, DNK ikki zanjirli U tezda renaturatsiya qilinadi, shuning uchun hosilni kamaytiradi. Odatda 90 ~ 95 ℃. Namuna bu haroratga yetgandan so'ng, uni tezda yumshatish haroratiga sovutish kerak. DNK denaturatsiyasi bir necha soniya davom etadi va bu uzoq vaqt talab qilinmaydi; aksincha, yuqori haroratda qo'lingizdan kelganicha harakat qilishingiz kerak. Taq DNK polimeraza faolligini saqlab qolish uchun uni qisqartiring. Taq DNK polimeraza qo'shgandan keyin maksimal denatürasyon harorati 95 ° C dan oshmasligi kerak.
2. Primerni yumshatish harorati Yuvish harorati PCRning o'ziga xosligini va rentabelligini aniqlaydi; agar harorat yuqori bo'lsa, o'ziga xoslik kuchli, lekin harorat juda yuqori bo'lsa, primer shablon bilan mustahkam birlashtirilmaydi va DNKni kuchaytirish samaradorligi pasayadi; harorat past, rentabellik yuqori, lekin juda past bo'lishi mumkin primer va shablonning mos kelmasligi , Non-maxsus mahsulotlar ko'payadi. Odatda, 37 ℃ reaktsiya holatidan boshlang, ma'lum bir reaktsiya uchun optimal tavlanish haroratini aniqlash uchun bir qator nazorat reaktsiyalarini o'rnating. Sinovni tushunish uchun primerlarning (G+C)% tarkibiga qarab ham xulosa qilish mumkin. Umumiy sinovning boshlang'ich nuqtasi, tavlanish harorati Ta (tavlanish harorati) erish haroratidan 5 ℃ past. Quyidagi formula bo'yicha hisoblash mumkin bo'lgan kuchaytiruvchi primerning TTm (erish harorati):
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Ular orasida A, T, G va C mos ravishda mos keladigan asoslar sonini ifodalaydi. Masalan, 20 ta asosli primer uchun (G+C)% ning tarkibi 50% bo'lsa, Ta ning boshlang'ich nuqtasi 55 ° C ga o'rnatilishi mumkin. Oddiy primer konsentratsiyasida (masalan, 0,2 mkmol / L) tavlanish reaktsiyasi bir necha soniya ichida yakunlanishi mumkin va uzoq muddatli tavlanish kerak emas.
3. Primer kengayish haroratini tanlash Taq DNK polimerazasining optimal haroratiga bog'liq. Odatda 70 ~ 75 ℃, 72 ℃ da ferment katalizlangan nukleotidlarning standart tezligi sekundiga 35 ~ 100 nukleotidga yetishi mumkin. daqiqada. 1kb uzunligi uzaytirilishi mumkin va uning tezligi bufer eritmasining tarkibiga, pH qiymatiga, tuz konsentratsiyasiga va DNK shablonining tabiatiga bog'liq. Agar kuchaytirilgan bo'lak 150bp dan qisqa bo'lsa, kengaytma bosqichi o'tkazib yuborilishi mumkin va u Taq DNK tufayli ikki haroratli tsiklga aylanadi. 100 dan 300 bp gacha bo'lgan qisqa ketma-ketlik fragmentlari uchun tez va oddiy ikki haroratli tsikldan foydalanish samaralidir. Bu vaqtda primerning kengayishi harorati tavlanish harorati bilan bir xil. 1kb dan yuqori DNK fragmentlari uchun uzaytirish vaqti fragment uzunligiga qarab 1 dan 7 minutgacha nazorat qilinishi mumkin. Shu bilan birga, Taq DNK polimerazasini uzoq vaqt davomida faol va barqaror ushlab turish uchun PCR buferiga jelatin yoki BSA reaktivi qo'shilishi kerak. Jinsiy aloqa; 15% -20% glitserin taxminan 2,5 kb yoki undan ortiq DNK fragmentlarini kuchaytirishga yordam beradi.
4. An'anaviy PCR tsikllari soni odatda 25 dan 40 gacha. Umumiy xatolik shundaki, tsikllar soni juda ko'p, o'ziga xos bo'lmagan fon jiddiy va murakkablik ortadi. Albatta, reaksiya sikllari soni juda kichik, unumdorligi esa past. Shuning uchun mahsulotning olinishini ta'minlash kerak. Tezlik asosida, tsikllar sonini minimallashtirish kerak.
Kuchaytirish tugagandan so'ng, namuna sovutiladi va 4 ° C da saqlanadi.
2. Primer Primer dizayni
Shablon DNKni kuchaytirish uchun siz avval ikkita oligonukleotid primerini loyihalashingiz kerak. Primer deb ataladigan narsa aslida kuchaytirilishi kerak bo'lgan maqsadli DNK ketma-ketligini to'ldiruvchi ikkita oligonükleotid fragmentidir. Ikki primer orasidagi masofa kuchaytirilgan bo'lakning uzunligini aniqlaydi. , Ikki primerning 5'uchlari kuchaytirilgan mahsulotning ikkita 5'uchlari o'rnini aniqlaydi. Ko'rinib turibdiki, primerlar PCR kuchaytirilgan bo'laklarning uzunligi, holati va natijalarini aniqlash uchun kalit bo'lib, primer dizayni muhimroqdir.
Primer dizayni uchun zaruriy shart shuki, primerni to'ldiruvchi maqsadli DNK ketma-ketligi ma'lum bo'lishi kerak. Ikki primer orasidagi ketma-ketlik aniq bo'lishi shart emas. Ma'lum bo'lgan ikkita ketma-ketlik odatda 15-20 ta asosdan iborat bo'lib, ular DNK sintezatori bilan sintezlanishi mumkin. Ikkita bir-birini to'ldiruvchi astarga mos keladigan, qo'shimcha ravishda, astar dizaynida odatda amal qiladigan printsiplar quyidagilarni o'z ichiga oladi:
1. Primer uzunligi statistik ma'lumotlarga ko'ra hisoblanadi va inson genomida taxminan 17 ta asosdan iborat oligonukleotidlar ketma-ketligi paydo bo'lishi ehtimoli bir marta. Shuning uchun primer uzunligi odatda 16 nukleotiddan kam emas, eng yuqorisi esa 30 nukleotiddan ko'p emas, eng yaxshi uzunlik esa 20-24 nukleotiddir. Bunday qisqa oligonukleotidlar polimerlanish haroratida (72°C dan yuqori) barqaror gibrid hosil qilmaydi. Ba'zan u 5 da bo'lishi mumkin' Genni klonlashni va boshqa maxsus ehtiyojlarni bajarish uchun cheklash fermenti saytlari yoki promotorlar kabi oxirida shablonga qo'shimcha bo'lmagan ketma-ketliklarni qo'shing; primer 5'end biotin yorlig'i yoki floresan yorlig'i mikroblarni aniqlash kabi turli maqsadlar uchun ishlatilishi mumkin.
Ba'zan primer't ishlamaydi, sababi noma'lum, uni hal qilish uchun pozitsiyani ko'chirishingiz mumkin.
2. (G+C)% tarkibidagi primerlarning tarkibi bir xil boʻlishi kerak va tarkibida bir xil asosiy polimerdan saqlanishga harakat qiling. Ikki primerdagi (G+C)% tarkibi imkon qadar oʻxshash boʻlishi kerak, maʼlum kuchaytirilgan fragmentdagi (G+C) % Tarkib kuchaytiriladigan fragmentga yaqin boʻlishi kerak, odatda. 40% dan 60% gacha yaxshiroq.
3. Astarning ichki qismi aniq ikkilamchi tuzilmalarning, ayniqsa, soch turmagi tuzilmalarining shakllanishiga yo'l qo'ymaslik kerak. Masalan:
4. Astarlar orasidagi ikkita astar o'rtasida, ayniqsa, primerning 3' oxirida hech qanday to'ldiruvchi bo'lmasligi kerak. Agar undan qochish mumkin bo'lmasa ham, 3'end to'ldiruvchi asos 2 tadan ko'p bo'lmasligi kerak, aks holda"primer dimer" hosil qilish oson; Yoki"Primer dimer" (Primer dimer). Primer dimer deb ataladigan narsa aslida DNK polimeraza ta'sirida bir primerning boshqa primer ketma-ketlikda kengayishi natijasida hosil bo'lgan ikki zanjirli DNK fragmentidir. , PCRning keng tarqalgan qo'shimcha mahsuloti bo'lib, ba'zan hatto asosiy mahsulotga aylanadi.
Bunga qo'shimcha ravishda, ikkita primer o'rtasidagi gomologik ketma-ketliklardan, ayniqsa, ketma-ket 6 dan ortiq bir xil asosga ega bo'lgan oligonükleotid fragmentlaridan saqlaning, aks holda ikkita primer shablonning bir xil joyi uchun bir-biri bilan raqobatlashadi; xuddi shunday, primerlar va kuchaytiriladigan maqsadli DNK Yoki namuna DNKsining boshqa ketma-ketliklari 6 tadan ortiq asosdan iborat gomologik ketma-ketlikka ega boʻlishi mumkin emas. Aks holda, primerlar boshqa joylarga bog'lanib, o'ziga xos kuchaytirishni kamaytiradi va o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirgichni oshiradi.
5. Primer 3'end juftlashuvchi DNK polimeraza primerning 3'uchiga bitta nukleotid qo'shadi. Shuning uchun, primerning 3'uchidan 5-6 ta asosni va maqsadli DNKni juftlashtirish talablari samarali PCR kuchaytirilishini ta'minlash uchun aniq va qat'iy bo'lishi kerak. .
Primer dizayni oqilona yoki yo'qligini PCRDESN dasturiy ta'minoti va Amerika PRIMER dasturlari yordamida kompyuterda qidirish orqali tekshirish mumkin.
Sun'iy ravishda sintez qilingan oligonükleotidlarni xromatografiya (xromatografiya) yoki PAGE orqali tozalash kerak, masalan, to'liq uzunlikdagi sintez qilinmagan qisqa zanjirlar kabi aralashmalar. 4 ° C da 25% asetonitril eritmasida saqlanadigan tozalangan primerlar mikroorganizmlarning oldini olishi mumkin Oddiy sharoitlarda foydalanilmagan primerlar muzlatgichda -20 ° C da saqlanishi kerak. Primerlar suyuqlikda 6 oy davomida saqlanishi mumkin va liyofilizatsiyadan keyin 1 yildan 2 yilgacha saqlanishi mumkin.
