1. Madaniyat plastinkasida PBS bilan ko'tarilgan slaydlarni har safar 3 daqiqa davomida uch marta namlang.
2. Slaydlarni 4 foizli paraformaldegid bilan 15 daqiqa davomida mahkamlang va slaydlarni PBSda 3 marta, har safar 3 daqiqa davomida namlang.
3. Xona haroratida 20 daqiqa davomida 0,5 foiz Triton X-100 (PBSda tayyorlangan) bilan o'tkazing (hujayra membranasida ifodalangan antijenler uchun bu bosqich o'tkazib yuboriladi).
4. Sarumni blokirovka qilish: slaydlarni har safar 3 daqiqa davomida PBSga 3 marta botiring, PBSni changni yutish qog'oz bilan quriting, slaydlarga oddiy echki zardobini qo'shing (agar ikkilamchi antikor manbai echki bo'lsa) va xona haroratida blokirovka qiling. 30 min.
5. Birlamchi antikor qo'shing: blokirovka qiluvchi eritmani changni yutish qog'oz bilan so'rib oling, yuvmang, har bir slaydga etarli miqdorda suyultirilgan birlamchi antikor qo'shing va uni nam qutiga soling, bir kechada 4 daraja inkubatsiya qiling.
6. Ikkilamchi lyuminestsent antikor qo'shing: slaydlarni PBSTga 3 marta, har safar 3 minutga botiring, changni yutish qog'oz bilan slaydlardagi ortiqcha suyuqlikni so'ring, suyultirilgan lyuminestsent ikkilamchi antikorni tomchilab qo'shing, 20-37 darajada 1 soat davomida inkubatsiya qiling. ho'l qutiga soling, PBST tilimga 3 marta, har safar 3 minut.
Eslatma: floresan ikkilamchi antikor qo'shilishidan boshlab, barcha keyingi qadamlar iloji boricha qorong'i joyda bajarilishi kerak.
7. Sarumni blokirovka qilish: suyuqlikni changni yutish qog'oz bilan artib oling, shisha slaydga oddiy echki zardobini tushiring (agar ikkilamchi antikor manbai echki bo'lsa) va xona haroratida 30 daqiqa davomida blokirovka qiling.
8. Birlamchi antikor qo'shing: blokirovka qiluvchi eritmani changni yutish qog'oz bilan so'rib oling, yuvmang, so'ngra suyultirilgan birlamchi antikorni tomchilab qo'shing va birlamchi antikor qo'shgandan so'ng qorong'ida 4 daraja nam qutida bir kechada inkubatsiya qiling. (Eslatma: ikkinchi birlamchi antikorning turlari birinchi asosiy antikor turlaridan farq qiladi, masalan, sichqon va quyon)
9. Ikkilamchi lyuminestsent antikor qo'shing: slaydlarni PBSTga 3 marta, har safar 3 minut botiring, changni yutish qog'oz bilan slaydlardagi ortiqcha suyuqlikni so'ring, suyultirilgan lyuminestsent ikkilamchi antikorni tomchilab qo'shing, 20-37 darajada 1 soat davomida inkubatsiya qiling. ho'l qutiga soling, PBST tilimga 3 marta, har safar 3 minut. (Eslatma: Agar birinchi antikorni aniqlash uchun qizil floresan tanlansa, ikkinchisi floresansning boshqa ranglarini tanlashi kerak)
10. Qarama-qarshi bo'yash yadrolari: DAPI tomchilab qo'shildi va qorong'ida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi, namunalar bo'yaldi va ortiqcha DAPI PBST 5 min × 4 marta yuvildi.
11. Slayddagi suyuqlikni changni yutish qog'oz bilan quriting, slaydni floresansga qarshi söndürücü bo'lgan o'rnatish suyuqligi bilan yoping va floresan mikroskop ostida tasvirlarni kuzating va yig'ing.
